Anwendung und Begrenzung einer biologischen Uhr

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 6093 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Schätzung des Todeszeitpunkts ist eines der wichtigsten Probleme in der Forensik. Hier haben wir die Anwendbarkeit, Einschränkungen und Zuverlässigkeit der entwickelten, auf der biologischen Uhr basierenden Methode bewertet. Wir analysierten die Expression der Uhrengene BMAL1 und NR1D1 in 318 toten Herzen mit definiertem Todeszeitpunkt mittels Echtzeit-RT-PCR. Zur Schätzung des Todeszeitpunkts wählten wir zwei Parameter, das NR1D1/BMAL1-Verhältnis und das BMAL1/NR1D1-Verhältnis für morgendliche bzw. abendliche Todesfälle. Das NR1D1/BMAL1-Verhältnis war bei morgendlichen Todesfällen signifikant höher und das BMAL1/NR1D1-Verhältnis war bei abendlichen Todesfällen signifikant höher. Geschlecht, Alter, postmortales Intervall und die meisten Todesursachen hatten keinen signifikanten Einfluss auf die beiden Parameter, mit Ausnahme von Säuglingen und älteren Menschen sowie schweren Hirnverletzungen. Obwohl unsere Methode möglicherweise nicht in allen Fällen funktioniert, ist unsere Methode für die forensische Praxis nützlich, da sie klassische Methoden ergänzt, die stark von der Umgebung beeinflusst werden, in der die Leiche untergebracht ist. Allerdings sollte diese Methode bei Säuglingen, älteren Menschen und Patienten mit schwerer Hirnverletzung mit Vorsicht angewendet werden.

Die oft äußerst schwierige Schätzung des Todeszeitpunkts ist eine der wichtigsten Aufgaben in der forensischen Praxis. Bis heute wurden zahlreiche Methoden zur Schätzung des Todeszeitpunkts entwickelt1,2. Im letzten Jahrzehnt wurden verschiedene innovative Techniken wie die Gewebe-Nanomechanik3, die auf Massenspektrometrie basierende quantitative Proteomik4, die Analyse der oralen Mikrobiota-Gemeinschaft5 und die Mikro-RNA-Analyse6 eingeführt, um das Postmortem-Intervall abzuschätzen, was zu erheblichen Fortschritten auf diesem Gebiet geführt hat. Die meisten dieser Methoden schätzen jedoch die Zeit seit dem Tod, nicht jedoch den Zeitpunkt des Todes. Die derzeitige Methode zur Schätzung des Todeszeitpunkts ist nach wie vor unbefriedigend.

Fortschritte in der Chronobiologie haben große Auswirkungen und Fortschritte in verschiedenen medizinischen Bereichen mit sich gebracht, beispielsweise in der Chronopharmakologie, Chronotherapie und Therapie von Schlafstörungen7,8,9,10,11,12,13,14. Die Chronobiologie kann zur forensischen Medizin beitragen, insbesondere bei der Schätzung des Todeszeitpunkts. Die forensische Anwendung der Chronobiologie ist jedoch recht begrenzt. Unseres Wissens gibt es derzeit nur einen Bericht über die Anwendung der Chronobiologie auf forensische Untersuchungen, in dem der Todeszeitpunkt anhand der Melatoninkonzentration im Zirbeldrüsenkörper, im Serum und im Urin geschätzt wurde15. Deshalb haben wir versucht, die biologische Uhr auf die Schätzung des Todeszeitpunkts anzuwenden. Im Jahr 2011 berichteten wir über die erste forensische Anwendung der Chronobiologie zur Schätzung des Todeszeitpunkts mithilfe eines Mausmodells und wandten die Methode auf einige Autopsiefälle an16. In unserem vorherigen Bericht verwendeten wir zwei Hauptoszillatorgene, Gehirn- und Muskel-Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor-Kerntranslokator-ähnlicher Typ 1 (BMAL1 oder ARNTL) und Kernrezeptor-Unterfamilie 1, Mitglied der Gruppe D 1 (Rev-Erbα, NR1D1), im zirkadianen Uhrsystem um die biologische Uhr in den Nieren, der Leber und dem Herzen abzulesen. Da diese beiden Uhrengene in entgegengesetzten Phasen oszillieren17,18, verstärkt das NR1D1/BMAL1-Verhältnis die zirkadiane Oszillation jeder Genexpression16. Wir haben die Anwendbarkeit unserer Methode in der forensischen Praxis nachgewiesen, konnten jedoch die Zuverlässigkeit und Grenzen der Methode nicht klären, da nur eine begrenzte Anzahl von Autopsiefällen untersucht wurde.

Seit ihrer Entwicklung haben wir die Methode in unserer Routinepraxis zur Schätzung des Todeszeitpunkts in Autopsiefällen angewendet. In dieser Studie haben wir unsere Methode anhand der Ergebnisse ihrer Anwendung auf 318 Autopsiefälle mit bekannten Todeszeiten in unserer Abteilung bewertet. Wir zeigen die praktische Anwendbarkeit und Grenzen unserer Methode, die den Todeszeitpunkt anhand der biologischen Uhr schätzt.

Die Verhältnisse NR1D1/BMAL1 (N/B) und BMAL1/NR1D1 (B/N) wurden gegen den Zeitpunkt des Todes aufgetragen, was zu deutlichen Spitzen um 6:00 bzw. 18:00 Uhr führte (Abb. 1a und b). dass die Clock-Genexpression auch in Leichen präzise nachgewiesen werden kann.

Zeitlicher Verlauf der N/B- und B/N-Verhältnisse in Autopsiefällen. Die Verhältnisse N/B (a) und B/N (b) wurden gegen den Zeitpunkt des Todes aufgetragen. Die Autopsiefälle wurden in vier Zeitbereiche unterteilt und die Verhältnisse N/B (c) und B/N (d) in jedem Zeitbereich wurden durch mehrere Vergleichstests untersucht. **p < 0,01, 3:00–8:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen; ##p < 0,01, 15:00–20:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen.

Abbildung 1c und d zeigen die Mittelwerte des N/B- und B/N-Verhältnisses in den vier Zeitbereichen (morgens, 3:00–8:59, mittags, 9:00–14:59, abends, 15:00). –20:59 und Nacht, 21:00–2:59). Die N/B- und B/N-Verhältnisse waren morgens und abends signifikant höher als in den anderen Zeitbereichen, was bestätigt, dass diese Verhältnisse geeignete Parameter zur Schätzung des Todeszeitpunkts sind. Allerdings wiesen die N/B- und B/N-Verhältnisse in einigen Autopsiefällen morgens bzw. abends sehr niedrige Werte auf (Abb. 1a und b), was darauf hindeutet, dass einige Faktoren diese Parameter beeinflussten.

Als nächstes untersuchten wir die Faktoren, die die Verhältnisse bei den Verstorbenen beeinflussen. Zunächst untersuchten wir geschlechtsspezifische Unterschiede im zeitlichen Muster der Verhältnisse (männlich, n = 224; weiblich, n = 94). Beide Geschlechter zeigten ein ähnliches zeitliches Muster der N/B- (Abb. 2a) und B/N-Verhältnisse (Abb. 2b). Die N/B- (Abb. 2c) und B/N-Verhältnisse (Abb. 2d) bei verstorbenen Männern waren morgens bzw. abends signifikant höher, was den Ergebnissen der Gesamtfälle ähnelte (Abb. 1c und d). Andererseits war das N/B-Verhältnis bei verstorbenen Frauen (Abb. 2c) morgens signifikant höher, was den Ergebnissen bei verstorbenen Männern ähnelt, wohingegen das B/N-Verhältnis abends höher war als zu anderen Zeiten Domänen, aber der Unterschied war statistisch nicht signifikant. (Abb. 2d).

Bewertung der Auswirkung des Geschlechts auf die Verhältnisse N/B (a) und B/N (b) in den Herzen der Verstorbenen. Die N/B- und B/N-Verhältnisse bei Männern (gefüllte Kreise, n = 224) und Frauen (offene Kreise, n = 94) wurden gegen den Todeszeitpunkt aufgetragen. Die Verhältnisse N/B (c) und B/N (d) in vier Zeitbereichen wurden bei Männern (durchgezogene Säulen) und Frauen (offene Säulen) durch mehrere Vergleichstests untersucht. **p < 0,01, 3:00–8:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen; ##p < 0,01, 15:00–20:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen.

Wir haben die Fälle in drei Altersgruppen eingeteilt (≤ 19 Jahre, n = 13; 20–69 Jahre, n = 200; ≥ 70 Jahre, n = 105). Alle Altersgruppen zeigten ähnliche zeitliche Muster (Abb. 3a–d). Das N/B-Verhältnis am Morgen war signifikant höher als in den drei anderen Zeitbereichen in den Gruppen 20–69 und ≥ 70 Jahre (Abb. 3c). Das B/N-Verhältnis am Abend war nur in der Gruppe der 20–69-Jährigen höher als in den drei anderen Zeitbereichen (Abb. 3d). Im Gegensatz dazu unterschied sich der zeitliche Verlauf des N/B-Verhältnisses am Morgen (3:00–8:59) und des B/N-Verhältnisses am Abend (15:00–20:59) nicht signifikant davon in anderen Zeitbereichen in der Gruppe ≤ 19 Jahre (Abb. 3c und d). Das N/B-Verhältnis am Morgen und das B/N-Verhältnis am Abend wurden gegen das Alter aufgetragen; Die Ergebnisse zeigten, dass die N/B- und B/N-Verhältnisse unabhängig vom Alter sind (Abb. 3e und f). Allerdings war die Fallzahl in der jungen und hohen Altersgruppe gering. Daher müssen mehr Fälle für die statistische Analyse dieser Gruppen herangezogen werden.

Bewertung des Einflusses des Alters auf die N/B (a)- und B/N (b)-Verhältnisse in den Herzen der Verstorbenen. Die Autopsiefälle wurden in drei Altersgruppen eingeteilt: ≤ 19 Jahre (gefüllte Kreise, n = 13), 20–69 Jahre (offene Kreise, n = 200) und ≥ 70 Jahre (graue Kreise, n = 105). Die Verhältnisse N/B (c) und B/N (d) in vier Zeitbereichen wurden in den Gruppen ≤ 19 Jahre (durchgezogene Säulen), 20–69 Jahre (offene Säulen) und ≥ 70 Jahre (graue Säulen) untersucht durch mehrere Vergleichstests. Die N/B-Verhältnisse im Zeitbereich 3:00–8:59 (e) und das B/N-Verhältnis im Zeitbereich 15:00–20:59 (f) wurden gegen das Alter aufgetragen. **p < 0,01, 3:00–8:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen; ##p < 0,01, 15:00–20:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen.

Schließlich untersuchten wir die Auswirkung der Obduktionsintervalle auf die Verhältnisse. Wir haben die Fälle in zwei Gruppen eingeteilt: < 30 Stunden Postmortem-Intervall (n = 250) und > 30 Stunden Postmortem-Intervall (n = 68). Die N/B- und B/N-Verhältnisse in beiden Gruppen zeigten morgens bzw. abends Spitzenwerte, was darauf hindeutet, dass das Obduktionsintervall praktisch keinen Einfluss auf sie hatte (Abb. 4a–f). Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied im B/N-Verhältnis zwischen den Abend- und Mittagszeitbereichen in der Gruppe mit Post-Mortem-Intervallen von > 30 Stunden (Abb. 4d). Dies ist wahrscheinlich auf die geringe Anzahl von Fällen (n = 9) im Mittagszeitbereich der Gruppe mit Post-Mortem-Intervallen von > 30 Stunden zurückzuführen. Das N/B-Verhältnis am Morgen und das B/N-Verhältnis am Abend wurden gegen das Postmortem-Intervall aufgetragen; Die Ergebnisse zeigten, dass die Verhältnisse unabhängig vom Postmortem-Intervall sind (Abb. 4e und f).

Bewertung der Auswirkung des postmortalen Intervalls auf die N/B (a)- und B/N (b)-Verhältnisse in den Herzen der Verstorbenen. Die Autopsiefälle wurden in zwei Gruppen mit postmortalen Intervallen unterteilt: < 30 Stunden (geschlossene Kreise, n = 250) und > 30 Stunden (offene Kreise, n = 68). Die N/B (c)- und B/N (d)-Verhältnisse in vier Zeitbereichen wurden in den Postmortem-Intervallgruppen < 30 Stunden (geschlossene Spalten) und > 30 Stunden (offene Spalten) durch mehrere Vergleichstests untersucht. Die N/B-Verhältnisse im Zeitbereich 3:00–8:59 (e) und die B/N-Verhältnisse im Zeitbereich 15:00–20:59 (f) wurden gegen das Postmortem-Intervall aufgetragen. **p < 0,01, 3:00–8:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen; ##p < 0,01, 15:00–20:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen.

Als nächstes untersuchten wir die Unterschiede im zeitlichen Muster der N/B- und B/N-Verhältnisse zwischen intrinsischen (n = 73) und extrinsischen (n = 245) Todesgruppen. Wie in Abb. 5a und b dargestellt, gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Bei den extrinsischen Todesfällen waren das N/B-Verhältnis am Morgen und das B/N-Verhältnis am Abend signifikant höher als in anderen Zeitbereichen (Abb. 5c und d). Allerdings war in den intrinsischen Todesfällen das N/B-Verhältnis am Morgen signifikant höher als in anderen Zeitbereichen, aber das B/N-Verhältnis am Abend unterschied sich nicht signifikant von denen in anderen Zeitbereichen (Abb. 5c und ). D). Wir haben auch die Auswirkung spezifischer Todesursachen auf die Verhältnisse untersucht. Die häufigsten Todesursachen (Tabelle 1), darunter hämorrhagischer und traumatischer Schock, Aortenruptur, Ertrinken, Verbrennungen, Erstickung, Vergiftung und ischämische Herzinsuffizienz, mit Ausnahme einer Hirnverletzung, schienen keinen signifikanten Einfluss auf die Verhältnisse zu haben (Daten). nicht gezeigt).

Bewertung der Auswirkung der Todesursache auf die N/B (a)- und B/N (b)-Verhältnisse in den Herzen der Verstorbenen. Die Autopsiefälle wurden in zwei Gruppen eingeteilt: intrinsischer Tod (geschlossene Kreise, n = 73) und extrinsischer Tod (offene Kreise, n = 245). Die Verhältnisse N/B (c) und B/N (d) in vier Zeitbereichen wurden in den Gruppen intrinsischer Tod (geschlossene Spalte) und extrinsischem Tod (offene Spalte) durch mehrere Vergleichstests untersucht. **p < 0,01, 3:00–8:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen; ##p < 0,01, 15:00–20:59 Zeitbereich im Vergleich zu anderen Zeitbereichen.

Bemerkenswert ist, dass Hirnverletzungen, insbesondere chronische Hirnverletzungen mit Hirnödem, Hirnhernie und Hirnhypoxie, die Verhältnisse in den Herzen der Verstorbenen stark zu beeinflussen schienen. Wie in Abb. 6a und b dargestellt, traten der morgendliche Höhepunkt des N/B-Verhältnisses und der abendliche Höhepunkt des B/N-Verhältnisses bei verzögertem Tod aufgrund einer chronischen Hirnverletzung (n = 15) nicht auf, wohingegen der Spitzenwerte der N/B- und B/N-Verhältnisse wurden bei akuten Todesfällen mit schwerer Hirnverletzung beobachtet (n = 35). Die Fälle von verzögertem Tod aufgrund einer chronischen Hirnverletzung zeigten keine Schwankung der N/B- und B/N-Verhältnisse (Abb. 6c und d). Bei akuten Todesfällen mit schwerer Hirnschädigung unterscheidet sich das N/B-Verhältnis morgens deutlich von dem abends (Abb. 6c). Diese Ergebnisse stammen jedoch von einer begrenzten kleinen Anzahl von Fällen, und der Verlust der Oszillation der N/B- und B/N-Verhältnisse aufgrund einer chronischen Hirnverletzung muss in weiteren Fällen bestätigt werden.

Bewertung der Auswirkung einer schweren Hirnverletzung auf die N/B (a)- und B/N (b)-Verhältnisse in den Herzen der Verstorbenen. Die Fälle schwerer Hirnverletzungen wurden in zwei Gruppen eingeteilt: Fälle mit sofortigem Tod durch akute Hirnverletzung (gefüllte Kreise, n = 35) und solche mit langwierigem Tod durch chronische Hirnverletzung mit Hirnödem, Hirnhernie oder Hirnhypoxie (leere Kreise, n = 15). Die N/B (c)- und B/N (d)-Verhältnisse in vier Zeitbereichen wurden in den Gruppen mit unmittelbarem Tod durch akute Hirnverletzung (geschlossene Spalten) und Langzeittod durch chronische Hirnverletzung (offene Spalten) durch mehrere Vergleichstests untersucht . **p < 0,01, Zeitbereich 3:00–8:59 gegenüber Zeitbereich 15:00–20:59. $p < 0,05, sofortiger Tod durch akute Hirnverletzung versus langwieriger Tod durch chronische Hirnverletzung.

Unsere Methode liest die biologische Uhr des Verstorbenen; Allerdings gibt es in der Uhr nur zwei Zeitbereiche (morgens, ca. 6:00 Uhr; abends, ca. 18:00 Uhr). Das N/B-Verhältnis eignet sich zum Lesen um 6:00 Uhr und das B/N-Verhältnis eignet sich zum Lesen um 18:00 Uhr. Bei allen Fällen, bei denen das N/B-Verhältnis > 25 war, handelte es sich um Todesfälle, die zwischen 1:00 und 10:00 Uhr auftraten (n = 40), und bei denen, bei denen das Verhältnis > 40 war, handelte es sich um Todesfälle, die zwischen 3:00 und 9:00 Uhr auftraten (n =). 23) (Abb. 7a). Andererseits handelte es sich bei allen Fällen, bei denen das B/N-Verhältnis > 1,5 war, um Todesfälle, die zwischen 14:00 und 22:00 Uhr auftraten (n = 39), und bei denen, bei denen das Verhältnis > 4 war, bei Todesfällen, die zwischen 15:00 und 20:00 Uhr auftraten :00 (n = 11) (Abb. 7b). Allerdings wurden mit unserer Methode nur 24,8 % (79/318) der morgendlichen und abendlichen Todesfälle vorhergesagt, und niedrige Werte der N/B- und B/N-Verhältnisse schließen morgens und abendliche Todesfälle nicht aus. Obwohl diese Methode daher nicht in allen Fällen wirksam ist, ist sie in der forensischen Praxis dennoch wichtig, da sie herkömmliche Methoden aus einer völlig anderen Perspektive ergänzt.

Kriterien für die Anwendung unserer Methode in der forensischen Praxis. Zeitlicher Verlauf des N/B-Verhältnisses im Herzen des Verstorbenen. (a) Fälle mit einem N/B-Verhältnis > 25 (rote Linie) hatten einen Todeszeitpunkt zwischen 1:00 und 10:00 (n = 40), und Fälle mit einem Verhältnis > 40 (blaue Linie) hatten einen Todeszeitpunkt zwischen 3:00 und 9:00 Uhr (n = 23). Zeitlicher Verlauf des B/N-Verhältnisses in den Herzen der Verstorbenen. (b) Fälle mit einem B/N-Verhältnis > 1,5 (rote Linie) hatten einen Todeszeitpunkt zwischen 14:00 und 22:00 Uhr (n = 39), und Fälle mit einem Verhältnis > 4 (blaue Linie) hatten einen Todeszeitpunkt zwischen 15:00 und 20:00 Uhr (n = 11).

Bisher schätzen die meisten Methoden zur Schätzung des Todeszeitpunkts die Zeit seit dem Tod und werden von internen, externen, antemortalen und postmortalen Bedingungen beeinflusst. Wir stellten die Hypothese auf, dass die biologische Uhr zum Zeitpunkt des Todes stoppt, und entwickelten eine Methode, um diese gestoppte biologische Uhr abzulesen16. Daher schätzt unsere Methode den Zeitpunkt des Todes, nicht die Zeit seit dem Tod, und scheint unabhängig von Umweltfaktoren zu sein; Sie kann jedoch durch interne Faktoren wie Alter, Geschlecht, Todesursache und Lebensstil des Verstorbenen beeinflusst werden. Die Zuverlässigkeit und Grenzen der praktischen Anwendung neu entwickelter Methoden müssen bewertet werden. Daher haben wir unsere Methode in einer erhöhten Anzahl von Fällen mit definiertem Todeszeitpunkt untersucht. Das N/B-Verhältnis zeigte um 6:00 Uhr einen Spitzenwert, was darauf hindeutet, dass die Methode ein stabiles Ergebnis liefern kann. Darüber hinaus untersuchten wir einen neuartigen Umkehrparameter, das B/N-Verhältnis, das gegen 18:00 Uhr einen Höhepunkt zeigte. Das N/B-Verhältnis war morgens hoch, während das B/N-Verhältnis abends hoch war; Daher können wir mit dieser Methode feststellen, ob der Tod morgens oder abends eingetreten ist. Bei Todesfällen gegen 6:00 Uhr bzw. 18:00 Uhr wurden jedoch häufig niedrige N/B- und B/N-Werte festgestellt. Solche unregelmäßigen Werte wurden in den Tierversuchen nicht beobachtet, da die Mäuse einen einheitlichen genetischen Hintergrund hatten und in einer streng kontrollierten Umgebung gezüchtet wurden16. Darüber hinaus wurden alle Mäuse schnell durch Zervixluxation unter tiefer Anästhesie getötet. Andererseits haben Menschen unterschiedliche genetische Hintergründe und leben in unterschiedlichen Zeitmustern (z. B. Schichtarbeiter), was sich auf das Expressionsmuster der Gene der biologischen Uhr auswirken könnte19,20.

In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass Geschlecht, Alter und postmortales Intervall (innerhalb von 96 Stunden nach dem Tod) keinen signifikanten Einfluss auf die N/B- und B/N-Verhältnisse haben. Allerdings wurden in begrenztem Umfang die jüngsten (< 1 Jahr alt, n = 5) und ältesten (> 90 Jahre alt, n = 14) Fälle sowie solche mit langen Obduktionsintervallen (> 48 h, n = 11) untersucht Nummer. Es ist bekannt, dass zirkadiane Rhythmen wie die Körpertemperatur und das Einschlafen in der Nacht innerhalb von 60 Tagen nach der Geburt auftreten21. Darüber hinaus wurde die zirkadiane Oszillation der Clock-Genexpression im SNC (suprachiasmatischer Kern) und einigen peripheren Geweben bei nichtmenschlichen Primatenföten bestätigt21, was darauf hindeutet, dass die Clock-Genexpression im Herzen menschlicher Säuglinge ebenfalls eine zirkadiane Oszillation aufweisen könnte. Daher scheint die auf der biologischen Uhr basierende Schätzung des Todeszeitpunkts auf Säuglingsfälle anwendbar zu sein. Allerdings beeinflusst mütterliches Melatonin die Uhrgenexpression bei nichtmenschlichen Primatenföten22, was darauf hindeutet, dass das Stillmuster die zirkadiane Uhr bei Säuglingen beeinflussen könnte. Daher könnten in zukünftigen Forschungen Unterschiede in den Clock-Genexpressionsmustern zwischen dem Herzen von Säuglingen und Erwachsenen festgestellt werden. Andererseits wurde berichtet, dass das Altern das zirkadiane Muster der Genexpression im menschlichen präfrontalen Kortex erheblich beeinflusst, was im Alter zu Veränderungen im zirkadianen Rhythmus führen könnte23. Unterschiedliche zirkadiane Rhythmen bei älteren Menschen, insbesondere das Ernährungsmuster, können die Genexpression der biologischen Uhr beeinflussen19,20. Da die biologische Uhr in den peripheren Geweben ebenfalls unter adrenerger Kontrolle steht24, könnten altersbedingte Veränderungen im beta-adrenergen Neuroeffektorsystem das Uhrgen-Expressionsmuster im Herzen älterer Erwachsener verändern25. Basierend auf den oben genannten Fakten sollte unsere Methode sorgfältig auf Säuglinge und ältere Erwachsene angewendet werden. Längere postmortale Intervalle könnten zu einer RNA-Verschlechterung führen26, was die Unsicherheit der Ergebnisse erhöht. Da die Fallzahlen bei Kindern, älteren Menschen und Fällen mit einem langen postmortalen Intervall gering sind, ist für eine statistisch aussagekräftige Diskussion eine Studie mit einer erhöhten Fallzahl erforderlich.

Die Todesursache schien die N/B- und B/N-Verhältnisse zu beeinflussen. Es gab jedoch keine signifikanten Unterschiede in den zeitlichen Mustern zwischen intrinsischen und extrinsischen Todesfällen. Darüber hinaus hatten die meisten Todesursachen keinen wesentlichen Einfluss auf die Verhältnisse. Ausnahmsweise verschwanden die Spitzen beider Verhältnisse bei Todesfällen mit Hirnödem, Hirnhernie oder Hirnhypoxie nahezu. Wir fanden auch eine Veränderung des N/B-Verhältnisses im Iliopsoas-Muskelgewebe von Fällen mit chronischer Hirnverletzung (nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass eine durch eine chronische Hirnverletzung verursachte SCN-Schädigung eine systemische Veränderung der Genexpression der peripheren Uhr mit sich bringt. Es wurde über Störungen des zirkadianen Rhythmus aufgrund eines Hirntraumas berichtet27,28,29. Kürzlich wurde in einem Rattenmodell über eine durch traumatische Hirnverletzungen verursachte Veränderung der Clock-Genexpression im SCN und Hippocampus berichtet30. Unser vorläufiges Ergebnis im Mausmodell der Wasservergiftung zeigte, dass ein Hirnödem eine Veränderung der biologischen Uhr im Herzen hervorrief (ergänzende Daten). Daher sollte die auf der biologischen Uhr basierende Schätzung des Todeszeitpunkts bei schweren Hirnverletzungen oder intrinsischem Tod mit Erkrankungen, die die Gehirnfunktion beeinträchtigen, wie z. B. schwerer hepatischer Enzephalopathie, mit Vorsicht angewendet werden.

In der vorliegenden Studie haben wir 318 Fälle analysiert. Es gab jedoch Verzerrungen bei der Anzahl der Fälle im Hinblick auf Geschlecht, Alter, Todesursache und andere Faktoren. Die Anzahl der Fälle lag in einigen Gruppen, beispielsweise bei Frauen, unter 100, und einige dieser Fälle zeigten keine statistische Signifikanz in den N/B- und B/N-Verhältnissen zwischen Morgen- und Abendzeitbereichen im Vergleich zu anderen Zeitbereichen. Daher sollte unsere Methode durch Studien mit einer größeren Anzahl von Fällen weiter validiert werden. Um eine Analyse mit einer ausreichenden Anzahl von Fällen durchzuführen, kann eine einrichtungsübergreifende Forschung erforderlich sein.

Kürzlich wurde über eine Analyse menschlicher Transkriptionsrhythmen mithilfe eines zyklischen Ordnungsalgorithmus namens Cyclops berichtet31. Der Cyclops-Algorithmus ermöglicht die Schätzung der zirkadianen Phase einer Probe aus Hochdurchsatzdaten, denen zeitliche Informationen fehlen, und dürfte ein innovativer Ansatz zur Schätzung des Todeszeitpunkts in der forensischen Praxis sein. Da es sich bei Cyclops um einen Algorithmus zur temporären Rekonstruktion bevölkerungsbasierter menschlicher Organdaten handelt, ist seine Nützlichkeit als Methode zur Schätzung des Todeszeitpunkts einzelner Autopsieproben in der forensischen Praxis ungewiss. Der Nutzen und die Probleme von Cyclops werden durch die Überprüfung in der forensischen Praxis geklärt. Ein weiteres Problem besteht darin, dass Hochdurchsatzanalysen für die Forensik derzeit teuer sind.

In der vorliegenden Studie konnte unsere Methode nur 79 Fälle von morgendlichen oder abendlichen Todesfällen von insgesamt 318 Fällen (ca. 25 %) vorhersagen. Dies weist darauf hin, dass unsere Methode nur in begrenzten Fällen funktioniert. Allerdings sind alle klassischen Methoden zur Schätzung des Todeszeitpunkts mit Unsicherheiten behaftet und basieren auf postmortalen Veränderungen, die mit dem Tod beginnen und von verschiedenen Umweltfaktoren beeinflusst werden. Im Gegensatz dazu schätzt unsere Methode die Todeszeit direkt auf der Grundlage der zirkadianen Uhr, die beim Tod stoppt und nicht von Faktoren beeinflusst wird, die postmortale Veränderungen beeinflussen. Wenn beispielsweise die Körpertemperatur einer verstorbenen Person die Umgebungstemperatur erreicht, ist es schwierig, die Zeit seit dem Tod anhand der Körpertemperatur abzuschätzen. Bei Tod durch Verbrennungen können viele klassische Schätzmethoden wie Körpertemperatur, Hornhauttrübung und Totenstarre nicht angewendet werden. Daher weisen alle klassischen Schätzmethoden Einschränkungen in ihrer Anwendbarkeit auf. Unsere Methode ergänzt herkömmliche Methoden aus einer völlig anderen Perspektive und kann dort eingesetzt werden, wo herkömmliche Methoden nicht anwendbar sind.

Zusammenfassend ermöglicht unsere Methode die Schätzung der morgendlichen und abendlichen Todesfälle durch Ablesen der N/B- und B/N-Verhältnisse im Herzen des Verstorbenen, unabhängig von Geschlecht, Alter, Obduktionsintervall und Todesursache. Obwohl die N/B- und B/N-Verhältnisse die Möglichkeit eines Todeseintritts am Morgen oder Abend nicht ausschließen können, ist unsere Methode in der forensischen Praxis dennoch wertvoll, da sie die klassischen Methoden, die auf postmortalen Veränderungen basieren, ergänzen kann. Da jedoch eine schwere Hirnverletzung die periphere zirkadiane Uhr stark beeinträchtigt, ist unsere Methode möglicherweise nicht auf Fälle schwerer Hirnverletzung anwendbar. Darüber hinaus muss die Anwendbarkeit der Methode auf Säuglinge und ältere Erwachsene in weiteren Fällen evaluiert werden.

Herzproben wurden aus 318 forensischen Autopsiefällen mit bekannten Todeszeiten (224 Männer und 94 Frauen) entnommen. Das Alter der obduzierten Probanden lag zwischen 2 Monaten und 97 Jahren (Durchschnitt: 58,7 Jahre), und die Obduktionsintervalle betrugen in allen Fällen weniger als 96 Stunden (Durchschnitt: 22,3 Stunden). Die Todesursachen der Probanden sind in Tabelle 1 aufgeführt. Bei der Autopsie wurden Gewebeproben entnommen, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Clock-Genexpression wird in unserem Institut routinemäßig in allen Autopsiefällen analysiert, um den Zeitpunkt des Todes abzuschätzen.

Gesamt-RNA wurde aus Gewebeproben (ca. 100 mg) extrahiert und mit dem Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit (Promega Corporation, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf das Maxwell System aufgetragen. Anschließend wurde 1 μg Gesamt-RNA unter Verwendung eines PrimeScript RT-Reagenzienkits (TAKARA BIO INC., Otsu, Japan) mit sechs Zufallsprimern (TAKARA BIO INC.) revers in cDNA transkribiert. Anschließend wurde die erzeugte cDNA einer qPCR-Analyse unter Verwendung eines SYBR® Premix Ex Taq™ II-Kits (TAKARA BIO INC.) mit spezifischen Primersätzen unterzogen (Tabelle 2). Amplifikation und Nachweis von mRNA wurden mit dem Thermal Cycler Dice® Real Time System (TP800, TAKARA BIO INC) durchgeführt.

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt. Der ungepaarte Student-T-Test und der Scheffe-F-Test wurden durchgeführt, um die Werte zwischen zwei Gruppen bzw. für mehrere Vergleiche zu vergleichen. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Unsere Studie wurde von der Forschungsethikkommission der Wakayama Medical University (Nr. 3177) genehmigt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Darüber hinaus wurde diese Studie anhand früherer Autopsieaufzeichnungen und Herzgewebe durchgeführt; Wir konnten von der Hinterbliebenenfamilie keine Einverständniserklärung zur Verwendung der Aufzeichnungen und des Herzgewebes einholen. In Übereinstimmung mit den „Ethischen Richtlinien für medizinische Forschung am Menschen (erlassen vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Soziales in Japan)“ Abschnitt. 12–1 (2) (a) (c) verzichtete das Prüfungsgremium des Forschungsethikausschusses der Wakayama Medical University auf die Notwendigkeit einer schriftlichen Einverständniserklärung von Verwandten der untersuchten Personen, da es sich um eine nicht identifizierte retrospektive Studie archivierter Autopsien handelte -abgeleitete Gewebe.

Die Autoren erklären, dass alle Daten auf Anfrage erhältlich sind. Alle Anfragen sind an Dr. Toshikazu Kondo zu richten.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Grants-in-Aids for Scientific Research (A) (Grant 25253055, an T. Kondo) vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Wissenschaft und Technologie unterstützt. Wir danken Frau Mariko Kawaguchi herzlich für ihre administrative Leitung der Forschung.

Abteilung für forensische Medizin, Wakayama Medical University, 811-1 Kimiidera, Wakayama, 641-8509, Japan

Akihiko Kimura, Yuko Ishida, Mizuho Nosaka, Akiko Ishigami, Hiroki Yamamoto, Yumi Kuninaka und Toshikazu Kondo

Abteilung für Herz-Kreislauf-Medizin, Kinan-Krankenhaus, Wakayama, Japan

Satoshi Hata

Abteilung für Neurologische Chirurgie, National Hospital Organization Minami Wakayama Medical Center, Wakayama, Japan

Mitsunori Ozaki

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AK trug zur Konzeptualisierung, Datenanalyse & Interpretation und Verfassen des Manuskripts. TK übernimmt die Verantwortung für die Datenintegrität und trug zum Studiendesign und zum Verfassen des Manuskripts bei. YI hat die Daten konzipiert und interpretiert. MN, AI, HY, YK und SH trugen zur Analyse der Autopsieproben bei. MO hat zu Tierversuchen beigetragen. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Toshikazu Kondo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kimura, A., Ishida, Y., Nosaka, M. et al. Anwendung und Einschränkung einer auf der biologischen Uhr basierenden Methode zur Schätzung des Todeszeitpunkts in forensischen Praxen. Sci Rep 13, 6093 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33328-3

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Eingegangen: 11. November 2022

Angenommen: 11. April 2023

Veröffentlicht: 13. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33328-3

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